Биопленки распространены повсеместно и могут содержать опасные условно-патогенные микроорганизмы. Биопленки образуются, когда планктонные бактерии вступают в контакт с влажной поверхностью и начинают выделять внеклеточные полимерные вещества (EPS), позволяя им прилипать к твердому субстрату (рис. 1). Как только бактерии прилипли, они начинают размножаться и увеличивать производство EPS, утолщая слой биопленки и закрепляя структуру на субстрате. Матрица EPS обеспечивает защиту от обычных методов дезинфекции и значительно затрудняет дезинфекцию микроорганизмов, заключенных в биопленку.

Эта повышенная проблема дезинфекции становится еще более проблематичной, когда условно-патогенные микроорганизмы (например, Pseudomonas aeruginosa и Legionella pneumophila ) находят убежище в биопленках. Инфекции, полученные от связанных с биопленкой бактерий, могут вызывать тяжелые заболевания и даже смерть у людей с ослабленной иммунной системой. 1 Бактерии, связанные с биопленкой, были связаны с 80% бактериальных инфекций в США 2 и являются общей проблемой для пищевой промышленности и здравоохранения. В клинических условиях биопленки могут загрязнять широкий спектр объектов инфраструктуры, инструментов и устройств, включая, помимо прочего, насадки для душа, накопители горячей воды, стоматологические водопроводы, эндоскопы, катетеры, кардиостимуляторы, протезы сердечных клапанов и т. Д.

3 Инфекции P. aeruginosa было показано, что приобретенные в клинических условиях повышают уровень заболеваемости и смертности пациентов. 4,5 В пищевой промышленности мясо, молочные продукты, рыба, птица и другие продукты подвержены риску загрязнения биопленкой, которое может возникнуть на любом этапе от выращивания до потребления. Основной риск загрязнения связан с контактом продукта с загрязненной технологической водой, рабочими поверхностями и оборудованием. 2 Загрязнение пищевых продуктов может в конечном итоге вызвать серьезные последствия для здоровья в случае употребления пищевых продуктов, а также может привести к финансовым потерям для компании из-за повышенной порчи и потери продукта.

3 Биопленки также являются общей проблемой в водной промышленности, поскольку они   могут образовываться на технологическом оборудовании для очистки воды (например, мембранных фильтрах), инфраструктуре распределительной системы, водопроводной системе помещений, резервуарах для хранения воды и вторичных резервуарах для хранения. Результаты предыдущих исследований показывают, что условно-патогенные микроорганизмы, включая Legionella , могут расти внутри биопленок-хозяев (например, простейших) в инфраструктуре питьевой воды. 6 Эти риски часто усугубляются в удаленных и / или децентрализованных приложениях, где технология очистки воды ограничена, а обслуживание систем питьевой воды на месте является обязанностью жителей или владельцев зданий с минимальной подготовкой (например, Farenhorst et al. 7 ). В секторах пищевых продуктов, здравоохранения и водоснабжения было реализовано множество стратегий борьбы с биопленками, включая химический контроль с помощью таких агентов, как гипохлорит натрия, перекись водорода, перуксусная кислота и озон 2 ; однако введение химических агентов в конечном итоге может привести к развитию устойчивых микробных популяций.

8,9 Другие типы методов контроля - такие как ультразвуковая обработка, фаги, ферментные растворы, УФ / H 2 O 2 и УФ / Cl 2 - также использовались для уменьшения образования биопленок. 2 Одно только УФ-облучение также изучалось многими исследователями с разными результатами. 10,11 Различные методы, используемые исследователями, применяющими УФ-облучение в различных нишах, могли привести к противоречивым результатам. Однако общим для всех этих исследований является открытие, что для достижения аналогичных уровней инактивации связанных с   биопленкой микроорганизмов по сравнению с планктонными (свободно плавающими) микроорганизмами требуется гораздо более высокая плотность энергии УФ-излучения . 10,12,13 Одно исследование показало, что это, вероятно, связано с высокой плотностью клеток в матрице EPS, что приводит к увеличению ослабления УФ-света по глубине биопленки.

10 Кроме того, сложная матрица EPS также может обеспечивать экранирующие эффекты. 14 Предыдущее исследование предполагает, что следует принять стратегию контроля, которая сначала разрушает или растворяет матрицу EPS с использованием поверхностно-активного вещества, поскольку это увеличит проникновение химических дезинфицирующих средств. 15 Аналогичный метод потенциально может быть использован для лучшего проникновения УФ-излучения в биопленки. Цели этой работы заключались в разработке стандартного протокола для инактивации P. aeruginosa в биопленках с помощью устройства с коллимированным пучком УФ-С LED, сравнение инактивации от УФ-C-облучения с коммерческими дезинфицирующими салфетками и исследование влияния применения коммерческих дезинфицирующих салфеток.

перед облучением УФ-С необходимо отключить. Разработка метода светодиодов UV-C Методологии, использованные в предыдущих исследованиях, были сосредоточены на применении УФ-излучения для смягчения воздействия биопленки, что отражает отраслевые вопросы, которые решаются исследователями, разработавшими эксперименты и аппаратуру. В результате трудно сравнивать и обобщать результаты этих исследований. Был разработан надежный и воспроизводимый метод выращивания, обработки и восстановления биопленок для экспериментов по инактивации светодиодов УФ-С. Полное описание этого стандартизированного метода можно найти в Gora, et al.

16 Биопленочный реактор CDC и метод, разработанный Агентством по охране окружающей среды США 17, были использованы для выращивания стабильных биопленок P. aeruginosa (PA01) на поликарбонатных купонах. Процесс роста состоял из двух стадий, направленных на стимулирование адгезии и созревания биопленок. На первом этапе в 500 мл богатой питательными веществами среды засевали 1 мл высококонцентрированного бульона P. aeruginosa и выдерживали при комнатной температуре в течение 24 часов.

Этот этап обеспечил прилипание бактерий к поверхности купона и начало образования биопленки. На втором этапе богатая питательными веществами среда медленно подавалась в реактор со скоростью приблизительно 10 мл / мин при комнатной температуре в течение дополнительных 24 часов. Эта стадия позволила прикрепленной биопленке развиться и созреть. UV-C-LED-обработка-CDC-биопленка-купоны-реакторы-покрытые-в-биопленки Paeruginosa Рисунок 2. Факторы, изученные для оптимизации УФ-C-светодиодной обработки образцов биопленки реактора CDC, покрытых биопленками P.

aeruginosa. Затем лечение было оптимизировано с помощью аппарата коллимированного луча UV-C LED (Aquisense Technologies, Кентукки, США) на основе трех факторов: количества обрабатываемых купонов, вращения по сравнению с отсутствием вращения и интенсивности УФ-излучения (рис. 2). Исследование показало, что повышенная инактивация была достигнута, когда образцы вращались со скоростью 5 об / мин, и что количество купонов и интенсивность светодиодов UV-C не влияли на инактивацию. Таким образом, было решено обрабатывать три купона одновременно с вращением на 5 об / мин с максимально возможной интенсивностью до конца исследования.

стандартизированный протокол биопленок во время экспериментов по инактивации УФ-С-светодиодами Рисунок 3. Стандартизованный протокол роста, лечения, восстановления и анализа биопленок Pseudomonas aeruginosa во время экспериментов по инактивации светодиода УФ-С. Соскоб и тампоны сравнивались как методы восстановления биопленки, а ручное перемешивание, встряхивание, обработка ультразвуком и протирание как методы ресуспендирования биопленки. Материалы и настройки, используемые для различных методов восстановления, были адаптированы из предыдущего исследования, посвященного эффективному удалению биопленки с кольцевых пластин реактора. 18 Повторно суспендированные образцы подсчитывали на чашках с триптическим соевым агаром (TSA) при 37 ° C в течение 18-24 часов.

Мы определили комбинацию методов восстановления и ресуспендирования, которая дала самый высокий выход клеток P. aeruginosa, и использовали ее в оставшейся части исследования. Краткое изложение рекомендованного стандартного метода обработки биопленок P. aeruginosa светодиодами УФ-С приведено на рисунке 3. Экспериментальный Используемый в этом исследовании светодиод UV-C с длиной волны 265 нм был охарактеризован и показал, что он имеет максимальную длину волны 268 нм и FWHM 11,5 нм.

Интенсивность УФ-С света, доставляемого к образцам, определялась путем измерения средней интенсивности по полю обработки трех купонов с помощью спектрометра USB4000, оборудованного детектором DET4-200-850 (Ocean Optics Inc., Флорида, США). . Измерения интенсивности проводились с пространственным разрешением 0,5 см на поверхности купонов. Общую интенсивность под спектром светодиода УФ-С собирали путем интегрирования пика от 220 до 300 нм для каждой точки в поле обработки.

После измерения средней интенсивности время экспозиции, необходимое для достижения флюенса УФ-излучения от 0 до 12 мДж / см 2, было рассчитано путем деления требуемого флюенса на среднюю интенсивность. Биопленки P. aeruginosa выращивали на поликарбонатных купонах в биопленочном реакторе CDC с использованием описанного выше метода. После роста загрязненные купоны подвергали обработке облучением светодиодами УФ-С, обычными дезинфицирующими салфетками или комбинацией протирания с последующим облучением светодиодами УФ-С. Плотность УФ-излучения от 0 до 60 мДж / см 2 применялась с использованием устройства с коллимированным пучком УФ-С LED (Aquisense Technologies).

Для протирки использовали обычные дезинфицирующие салфетки (Cavi-Wipes, Metrex; Orange, Калифорния, США) либо за один проход, либо контактировали с поверхностью в течение 15 секунд. Изопропиловый спирт (17,2%) и хлорид аммония (0,28%) являются активными ингредиентами салфеток Cavi-Wipes. результаты и обсуждение Было показано, что инактивация только после УФ-обработки выходит на плато при уменьшении приблизительно на 1,3 логарифма после УФ-флюенса 8 мДж / см 2 (данные не показаны, см. Публикацию по кинетике 16 ). Это не было полностью неожиданным, поскольку было показано, что для инактивации связанных с биопленкой микроорганизмов требуется значительно более высокая плотность энергии по сравнению со свободно плавающими планктонными клетками.

Например, исследования показали, что при плотности энергии приблизительно 4 мДж / см 2 можно достичь аналогичной логарифмической инактивации 2 log в чистой суспензии планктонных P. aeruginosa . 19 При изучении местных бактериальных сообществ в катетерах было показано, что плотность потока УФ излучения, необходимая для достижения 4 log инактивации в сообществе биопленок, была в 10 раз больше, чем у ресуспендированной биопленки. 10 В другом исследовании авторы изучили инактивацию P. aeruginosa с помощью светодиода УФ-С в биопленках, сформированных на катетерах, и обнаружили, что 4-логарифмическая инактивация может быть достигнута с флюенсом 7,9 мДж / см 2 .

20 Обработка только коммерческими дезинфицирующими салфетками привела к минимальным различиям между однократным проходом и 15-секундным временем контакта и немного увеличила потенциал дезинфекции по сравнению с одной обработкой светодиодами УФ-С. Однако при использовании в сочетании с облучением светодиодами UV-C наблюдались синергетические эффекты. Например, снижение в 2,3 логарифма было достигнуто за один проход имеющейся в продаже дезинфицирующей салфетки, а при нанесении на биопленку флюенса 12 мДж / см 2 - 1,3 логарифма. Когда оба метода использовались в комбинации, полученные чашки содержали слишком мало колоний для подсчета, что указывает на то, что была достигнута инактивация с логарифмом более 7,8. Это говорит о том, что инактивация до 4,2 логарифма потенциально была связана с синергетическим эффектом между протиранием и обработкой светодиодами УФ-С.

комбинированное лечение синергетическое воздействие на Paeruginosa Рис. 4. Комбинированная обработка имеющимися в продаже дезинфицирующими салфетками и светодиодами УФ-С имела потенциальное синергетическое воздействие на P. aeruginosa (* в одном экземпляре снижение log> 7,8). Было высказано предположение, что эти эффекты могли возникнуть из-за того, что протирание разрушило биопленку и уменьшило любой экранирующий эффект, который матрица EPS могла оказывать клеткам (см.

Рисунок 4). Взаимодействие между остаточными химическими веществами от салфеток и УФ-излучением также могло способствовать улучшению инактивации. Механизм (ы), лежащий в основе синергических эффектов, о которых здесь сообщается, является центром текущих исследований по предотвращению образования биопленок и смягчению их последствий на поверхностях. Это исследование продемонстрировало, что эффективность обработки поверхностей из поликарбоната, загрязненных биопленками P. aeruginosa, была значительно улучшена за счет протирания коммерческими дезинфицирующими салфетками с последующим облучением светодиодами УФ-С.

Биопленка на основе УФ-С-светодиодов, клиническая и пищевая Рис. 5. Возможные области применения стратегий предотвращения образования биопленок на основе светодиодов UV-C и борьбы с ними в клинических условиях и в сфере пищевых продуктов. Хотя эти результаты могут не подходить для всех областей, где могут потребоваться стратегии контроля биопленки (Рисунок 5), считается, что представленный протокол позволит исследователям изучить, как такие факторы, как активные ингредиенты в дезинфицирующих салфетках, материалы субстрата, виды бактерий и длины волн УФ-излучения влияют на инактивацию связанных с биопленкой микроорганизмов. Заключение В этом исследовании был изучен лучший метод систематической обработки биопленок P.

aeruginosa, выращенных на поликарбонатных купонах, с помощью устройства с коллимированным пучком УФ-С LED. Метод, разработанный на основе этой работы, обеспечивает надежный лабораторный протокол для исследования реакции инактивации связанных с биопленкой бактерий, который может быть адаптирован для других отраслевых потребностей. В этом исследовании также изучалась эффективность обычно используемых салфеток с изопропаноловым дезинфицирующим средством для уменьшения образования биопленок и влияние расчесывания салфеток с помощью УФ-излучения светодиода. Когда оба метода были объединены, было достигнуто снижение P. aeruginosa на 7,9 логарифма , что намного превышает снижение, наблюдаемое при любом лечении отдельно.

Механизмы, лежащие в основе этих синергетических эффектов, в этом исследовании не изучались, но предполагается, что повышенное сокращение количества клеток, вероятно, было связано с механическим и / или химическим разрушением матрицы EPS до применения УФ-излучения. Эта гипотеза в настоящее время проверяется в лаборатории. Результаты этого исследования показывают, что двухэтапный подход к лечению, сочетающий дезинфицирующие салфетки и УФ-излучение светодиодами, может оказаться очень эффективным для контроля биопленки на поверхностях.